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武漢賽科成科技有限公司

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    基于武漢賽科成SKC300生物反應(yīng)器無(wú)血清培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞
    發(fā)布日期：2023.07.28

    干細(xì)胞作為一種能夠自我更新和分化的細(xì)胞類型，自被發(fā)現(xiàn)起，干細(xì)胞就一直是研究熱點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC）是成體干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，后期研究發(fā)現(xiàn)MSC廣泛存在于人體的許多種組織中。MSC具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)。如MSC在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、骨髓基質(zhì)和心肌細(xì)胞分化能力，不僅如此，它還可以跨胚層分化為神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、胰島細(xì)胞等。經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的工具細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。

    MSC已成臨床研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)。截止2021年4月，在ClinicalTrials.gov網(wǎng)站檢索到的間充質(zhì)干細(xì)胞臨床試驗(yàn)超過(guò)1200個(gè)。近年來(lái)，這個(gè)數(shù)字持續(xù)增長(zhǎng)，表明間充質(zhì)干細(xì)胞的重要性日益增強(qiáng)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球曾經(jīng)獲準(zhǔn)上市的間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品有18款，符合藥品定義的有10款。目前，我國(guó)的干細(xì)胞藥物研發(fā)愈發(fā)規(guī)范，吸引大量資本和人才進(jìn)入。

    全球干細(xì)胞療法大多處在技術(shù)到產(chǎn)品轉(zhuǎn)化的階段。在體外進(jìn)行細(xì)胞規(guī)模化的高效擴(kuò)增MSC，是應(yīng)用和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。本研究基于微載體，利用賽科成SKC300生物反應(yīng)器無(wú)血清培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)具有良好的應(yīng)用前景。

    01 

    實(shí) 驗(yàn) 材 料

    細(xì)胞：間充質(zhì)干細(xì)胞

    培養(yǎng)方式：微載體Cytodex 1貼壁培養(yǎng)

    培養(yǎng)基：干細(xì)胞培養(yǎng)基

    反應(yīng)器：賽科成SKC300生物反應(yīng)器-7.5L

    SKC300+攪拌槳.jpg

    圖1 賽科成SKC300生物反應(yīng)器及攪拌槳


    02 


    實(shí) 驗(yàn) 步 驟

    1. 微載體預(yù)處理 

    1.1微載體處理：Cytodex1使用DPBS溶脹3h。

    1.2使用DPBS洗滌2次Cytodex1，DPBS浸泡后滅菌（121℃，30min）。

    1.3 Cytodex1瓶?jī)?nèi)棄上清，瓶?jī)?nèi)無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次。

    2. 賽科成SKC300生物反應(yīng)器的操作 

    2.1 使用前極化pH,DO電極6小時(shí)，校準(zhǔn)pH電極。

    2.2 SKC300罐體121℃滅菌1小時(shí)后，與控制系統(tǒng)連接好。將培養(yǎng)液從儲(chǔ)液袋加入到罐體內(nèi)。

    2.3 無(wú)菌實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)速：40-60rpm，pH：7.4，DO：50%，流量0.2L/min，三氣體或四氣體模式。

    3. MSC細(xì)胞培養(yǎng)及接種過(guò)程 


    3.1 按6000cells/cm2接種新鮮MSC細(xì)胞至微載體培養(yǎng)液中，將微載體和細(xì)胞的混合懸液一起加入到罐體中。

    3.2 培養(yǎng)參數(shù)轉(zhuǎn)速：40-60rpm，pH：7.4，DO：50%，流量0.2L/min，三氣體模式。

    3.3 每天從罐內(nèi)無(wú)菌取樣口用無(wú)菌注射器抽取5ml-10ml培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，生化，鏡檢，支原體、內(nèi)毒素等安全性質(zhì)量檢測(cè)。

    3.4 培養(yǎng)4-5天收獲。

    4. MSC細(xì)胞的收獲 

    4.1培養(yǎng)4-5天后將罐內(nèi)微載體懸浮液從罐內(nèi)轉(zhuǎn)移至消化袋（消化袋如圖2所示）。

    4.2 直接抽出上清，DPBS洗滌兩遍，加入Tryple消化酶，溫和搖勻消化6min-15min。從取樣口取樣觀察消化情況，當(dāng)細(xì)胞完全與微載體分開后，從袋內(nèi)抽出細(xì)胞懸液。加入DPBS洗滌2遍。

    4.3 細(xì)胞懸液400×g離心，5min。收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

    消化袋截圖.png

    圖2 賽科成自主研發(fā)生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)消化袋


    03 



    實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果

    ① 細(xì)胞生長(zhǎng)情況

    按6000cells/cm2接種新鮮MSC細(xì)胞至微載體，培養(yǎng)4天后細(xì)胞在微載體生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3。

    MSC細(xì)胞01.png

    圖3微載體培養(yǎng)MSC

     ② 細(xì)胞消化情況

    轉(zhuǎn)移至消化袋后利用Tryple消化酶，溫和搖勻消化6min-15min，細(xì)胞消化狀態(tài)如圖4所示。

    MSC細(xì)胞02.png

    圖4 細(xì)胞消化狀態(tài)（消化12min）

     ③ 細(xì)胞密度情況

    接種后每天從罐內(nèi)無(wú)菌取樣口用無(wú)菌注射器抽取5ml-10ml培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖5所示。


    微載體細(xì)胞生長(zhǎng)圖01.png

    圖5A 細(xì)胞密度（微載體密度12g/L）

    微載體密度02.png

    圖5B 細(xì)胞密度（微載體密度18g/L）


    根據(jù)上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在賽科成SKC300生物反應(yīng)器培養(yǎng)MSC細(xì)胞不僅可以高密度微載體培養(yǎng)，而且具有良好的一致性。



    參考文獻(xiàn)

    [1] Y Jiang, Jahagirdar, N Balkrishna,et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.[J]. Nature, 2002.

    [2] 王蓓, 汪維偉. 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué):外科學(xué)分冊(cè), 2005.

    [3] Vallone V, Romaniuk M A, Choi H , et al. Mesenchymal stem cells and their use in therapy: What has been achieved?[J]. Differentiation, 2013.

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